Lumineszenz-Untersuchungen zur Generierung und Relaxation von Singulett-Sauerstoff in zellulärer Umgebung

Jürgen Baier

Universität Regensburg - Institut Physik II: Experimentelle und Angewandte Physik, November 2005

Abstract (english)
Singlet molecular oxygen is one of the most active intermediates involved in photosensitized oxygenation reaction in chemical and biological systems. Among others, singlet oxygen can be generated by an energy transfer of a light absorbing photosensitizer, e.g. in photodynamic therapy. The UVA component of solar radiation (320 - 400 nm) has been also shown to produce deleterious biological effects in which singlet oxygen plays a major role. The non-radiative deactivation of singlet oxygen is accompanied by radiative deactivation leading to infrared luminescence at 1270 nm, which is widely employed for singlet oxygen detection. Usually, the decay time of singlet oxygen luminescence is measured using short laser pulses. The decay time is correlated to the respective environment of singlet oxygen which is mostly a solvent containing a photosensitizer. To measure the very weak luminescence intensity, highly sensitive detectors such as infrared photomultiplier have to be used. Singlet oxygen was generated by energy transfer from the photo-excited sensitizer, Photofrin or 9-acetoxy-2,7,12,17-tetrakis-(beta-methoxyethyl)-porphycene (ATMPn), to molecular oxygen. Singlet oxygen was detected time-resolved by its luminescence at 1270 nm in an environment of increasing complexity, water (H2O), pure phosphatidylcholine, phosphatidylcholine in water (lipid suspensions), and aqueous suspensions of living cells. In case of the lipid suspensions, the sensitizers accumulate in the lipids, whereas the localizations in the cells are the membranes containing phosphatidylcholine. Using Photofrin, the measured luminescence decay times of singlet oxygen were 3.5±0.5 µs in water, 15±2 µs in lipid, 8±2 µs in aqueous suspensions of lipid droplets and 10±3 µs in aqueous suspensions of human colonic cancer cells (HT29). The decay time in cell suspensions was much longer than in water and was comparable to the value in suspensions of phosphatidylcholine. That luminescence signal should be attributed to singlet oxygen decaying in the lipid areas of cellular membranes. In view of the increasing resistance of bacteria to antibiotics, photodynamic inactivation of bacteria is a promising new technique. After incubation of E. coli with Photofrin no singlet oxygen luminescence was detected. When incubating S. aureus with Photofrin, a singlet oxygen luminescence decay time of 6±2 µs was measured. Obviously, the decay time of luminescence is an intermediate time of singlet oxygen decaying in phospholipids (14±2 µs) of membranes and in surrounding water (3.5±0.5 µs). Thus, singlet oxygen seems to decay in outer cell wall areas of S. aureus, which is then the subcellular localization of Photofrin. The luminescence decay time in large agglomerates of bacteria was much longer (40±16 µs) than in suspension with single bacteria. Riboflavin, Flavin Mononucleotide Sodium (FMN), Flavin Adenine Dinucleotide Disodium Salt Hydrate (FAD), Nicotinamide Adenine Dinucleotide Sodium Salt (NAD), Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate Hydrate (NADP), phosphatidylcholine or cholesterol in solution were excited at 355 nm. Singlet oxygen was directly detected by time resolved measurement of its luminescence at 1270 nm. NAD, NADP and Cholesterol showed no luminescence signal, which might be due to the very low absorption coefficient at 355 nm. For urocanic acid, singlet oxygen luminescence was clearly detected but the signal was too week to quantify a quantum yield. Phosphatidylcholine also generates a singlet oxygen luminescence signal where singlet oxygen is produced chemically (type I-reaction). When exciting Riboflavin, FMN and FAD the singlet oxygen luminescence was sufficient to determine the quantum yields of singlet oxygen using perinaphthenone as reference (Riboflavin 0.54 ± 0.07, FMN 0.51 ± 0.07 and FAD 0.07 ± 0.02). When exposing keratinocytes (NHEK) or HT29 cells to UVA light at 355 nm, a clear singlet oxygen luminescence was measured. An important source of singlet oxygen might be lipids (phosphatidylcholine). In this thesis, an improved detection system is shown which leads to a better detection of singlet oxygen by its luminescence. In particular a time resolved luminescence signal of singlet oxygen in living cells could be measured for the first time.

Abstract (deutsch)
Unter den reaktiven Sauerstoffspezies, die durch lichtaktivierte Photosensibilisatoren im Rahmen von Photochemotherapien erzeugt werden, spielt der Singulett-Sauerstoff eine zentrale Rolle bei der photodynamischen Therapie. Bei der Wechselwirkung von UVA-Licht und Gewebe ist die Erzeugung von Singulett-Sauerstoff ebenfalls bedeutend. Die Aufklärung der photophysikalischen Vorgänge im Rahmen der Wechselwirkung zwischen Photosensibilisator, Sauerstoff und Umgebung ist von grundlegender Bedeutung für das Verständnis der Singulett-Sauerstoff-Generierung und deren Auswirkungen. Dazu wurde die zeitaufgelöste Detektion der Singulett-Sauerstoff-Lumineszenz bei 1270 nm verwendet. Zum Einsatz kam ein hochempfindlicher Infrarot-Photomultiplier und eine schnellen Zähleinrichtung, so dass das verwendete Detektionssystem bezüglich der zeitaufgelösten Messung der Singulett-Sauerstoff-Lumineszenz eine entscheidende Verbesserung darstellt. Dadurch konnte das Verhalten von Photosensibilisator und Singulett-Sauerstoff in komplexer werdender Umgebung betrachtet werden. Um das Verhalten von Singulett-Sauerstoff in Zell-Suspensionen zu verstehen, wurden als Zwischenschritt Lipid-Suspensionen untersucht. Die Lebensdauer von Singulett-Sauerstoff in reinem Phosphatidylcholin konnte zu (15±3) µs bestimmt werden. In der Suspension aus H2O und Lipid spielt die Diffusion des Sauerstoffs durch Lipid- und Wasserbereiche eine entscheidende Rolle. Dadurch ergibt sich z.B. die Gesamtlebensdauer von Singulett-Sauerstoff als Zwischenzeit von (7,3±1,1) µs (15 mg/ml Lipid in H2O) die durch die Lebensdauer von Singulett-Sauerstoff in Wasser von (3,5±0,5) µs und in Lipid von (15±3) µs bestimmt ist. Für die Zell-Suspensionen wurden sowohl eukaryotische Zellen (HT29) als auch prokaryotische Zellen (Staphylococcus aureus) verwendet. Im Fall der HT29-Zellen in H2O zeigte sich, dass die Lebensdauer von Singulett-Sauerstoff vom Ort der Erzeugung abhängt. Je nach verwendetem Photosensibilisator und Inkubationszeit konnte der Ort variiert werden. In der Zellmembran z.B. lebt der Singulett-Sauerstoff (10±3) µs. Durch die Diffusion von Singulett-Sauerstoff sind die Lebensdauern wieder als Zwischenzeiten, analog zu den Lipidsuspensionen, zu betrachten. Aufgrund der hier gemessenen langen Lebensdauern von Singulett-Sauerstoff, gegenüber der kurzen Lebensdauer von (3,5±0,5) µs im Wasser, muss das Lumineszenzsignal aus der Zelle und nicht aus dem Wasser stammen. Somit konnte Singulett-Sauerstoff direkt in lebenden Zellen nachgewiesen werden. Im Fall Bakterien in H2O hat sich gezeigt, dass die Lebensdauer von Singulett-Sauerstoff von der Bakterien-Konzentration abhängt. Die Lebensdauer von Singulett-Sauerstoff lässt sich hier als Zwischenzeit betrachten, die durch die Lebensdauer von Singulett-Sauerstoff im Wasser und im Bakterium bestimmt ist. Bei einzelnen Bakterien im Wasser lebt der Singulett-Sauerstoff (6±2) µs. Bei hohen Bakterien-Konzentrationen klumpen diese traubenförmig zusammen, so dass das Lösungsmittel H2O eine untergeordnete Rolle spielt und die Bakterienzeit dominiert. Aus diesem Zusammenhang konnte die Lebensdauer von Singulett-Sauerstoff in reinen S. aureus-Bakterien zu (40±16) µs bestimmt, sowie der Entstehungsort von Singulett-Sauerstoff im Randbereich der Bakterien ermittelt werden. Mit Hilfe von UVA-Licht bei 355 nm konnte die Erzeugung von Singulett-Sauerstoff durch endogene Substanzen nachgewiesen werden. Es wurden nur Stoffe verwendet und untersucht, die auch in lebenden Zellen vorkommen. Exogene Photosensibilisatoren wurden nicht eingesetzt. Für die Substanzen Riboflavin, Flavin-Mononukleotid (FMN), Flavin-Adenin-Dinukleotid (FAD), Urocaninsäure und Phosphatidylcholin in Lösung konnte die Erzeugung von Singulett-Sauerstoff durch UVA-Licht nachgewiesen werden. Im Fall Phosphatidylcholin erfolgt die Erzeugung von Singulett-Sauerstoff chemisch über die Typ-I-Reaktion. Für die Flavine wurde die Singulett-Sauerstoff-Quantenausbeute bestimmt. Es zeigt sich, dass Riboflavin als strukturell einfachstes Flavin die höchste Singulett-Sauerstoff-Quantenausbeute (0,54±0,07) hat. Die HT29- und NHEK-Zellsuspensionen erzeugten, durch UVA-Bestrahlung bei 355 nm, ebenfalls Singulett-Sauerstoff. In allen Fällen konnte die Lebensdauer von Singulett-Sauerstoff in diesen Systemen bestimmt werden. Mit der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass das beschriebene, neuartige Detektionssystem eine wesentliche Verbesserung für den direkten, lumineszenzspektroskopischen Nachweis des Singulett-Sauerstoffs darstellt. Es konnte insbesondere Singulett-Sauerstoff erstmals direkt in lebenden Zellen nachgewiesen und die Lebensdauer von Singulett-Sauerstoff in dieser Umgebung bestimmt und interpretiert werden.